|
|
Knockout isoforem metalothioneinu pomocí metody CRISPR-Cas9 u adherentních tkáňových kultur
Duda, Jakub
Modifikace genomů byly ještě donedávna velmi složité a v některých případech i nemožné, s objevením a popsáním systému CRISPR u prokaryot však přišla řada průlomů, díky nimž byl systém CRISPR modifikován pro užití jakožto nástroj pro editaci genomu u eukaryotických organismů. Genetické modifikace by teoreticky mohly být klíčové při novodobé terapii rakoviny, a tato práce se zaměřuje na proteiny Metalothioneiny, které se v organismech běžně vyskytují a jsou organismu prospěšné (například jakožto inhibitory oxidativního stresu a nebo antioxidanty navazující na sebe těžké kovy), ale podle isoformy a také typu tkáně mohou buďto svou přítomností, nebo absencí zapříčinit rozvoj rakoviny a růst nádorů. Cílem této práce bylo zaměření se na možnost zavedení knock-outu pomocí metody CRISPR/Cas9 u všech isoforem metalothioneinů najednou, a tím ovlivnění jednoho z velmi významných faktorů karcinogeneze. Výsledkem této práce je dosažení knock-outu u isoformy MT3.
|
|
|
Neuronální buněčné kultury in vitro
Kohoutová, Šárka ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Neuronální buněčné kultury jsou in vitro kultury disociovaných neuronů, které se již v minulém století staly neodmyslitelnou součástí mnoha neurobiologických experimentů. Kultivované neurony umožňují nejen odpovědět na otázky ohledně jejich fyziologie v komplexních in vivo podmínkách, ale rovněž mohou sloužit jako modely neurodegenerativních onemocnění. Neuronální buňky lze izolovat buďto přímo z nervové tkáně živočichů v prenatálním či dospělém stádiu vývoje, nebo jsou získávány skrze cílené manipulace kmenových buněk a sekundárních buněčných linií, které vedou k jejich neuronální diferenciaci. Primární neurony jsou považovány za zlatý standard neurobiologického výzkumu nejen z důvodu, že jejich kultivace má dlouholetou tradici, ale také proto, že odráží typické vlastnosti neuronů v in vivo podmínkách. S primárními neurony je spojena řada nevýhod, včetně skutečnosti, že plně diferencované neurony neproliferují a jsou poměrně náročné na kultivační podmínky. Z tohoto důvodu jejich roli často nahrazují mitoticky aktivní sekundární buněčné linie či kmenové buňky. Tato bakalářská práce shrnuje poznatky o buněčných kulturách využívaných ke studiu funkcí nervových buněk a poukazuje na výhody a nevýhody jejich využití. Klíčová slova Primární neurony, primární hipokampální neurony, neurální kmenové buňky,...
|
|
|
Vliv chromatinu na opravu dvouvláknových zlomů DNA po štěpení CRISPR/Cas a dalších programovatelných nukleáz u rostlin
Trojan, Jakub ; Přibylová, Adéla (vedoucí práce) ; Procházková, Klára (oponent)
Rostliny mají velkou odolnost vůči ionizujícímu záření i díky kvalitnímu opravnému aparátu na opravu dvouvláknových zlomů. Dvouvláknové zlomy jsou v rostlinách opravovány čtyřmi hlavními drahami. Nejčastěji probíhá rychlá oprava pomocí nehomologního spojování konců (NHEJ), spojující konce DNA bez většího zpracování. Přesnější, zato pomalejší a složitější, je oprava prostřednictvím homologní rekombinace (HR) využívající k opravě dlouhé úseky homologního řetězce DNA. Využívaná je přednostně v oblasti aktivních genů během S a G2 fáze buněčného cyklu. Opravy probíhají dále skrze Theta zprostředkované spojování konců (TMEJ) a single strand annealing (SSA). Obě tyto dráhy jsou řízené kratší homologií mezi konci DNA vytvořenými dvouvláknovým zlomem. Často opomíjenou součástí oprav je i překonávání represivních vlastností chromatinu, který chrání genom před poškozením a přístupem nukleáz, ale zároveň brání i přístupu opravných proteinů. Tato práce shrnuje dosavadní znalosti o opravách DNA u rostlin a vlivu chromatinu ne pouze na ně, ale i na aktivitu programovatelných nukleáz využívaných v genovém inženýrství, jako jsou zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALEN) a clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR associated (CRISPR/Cas). Klíčová...
|
|
|
Molekulárně-biologická diagnostika lidských polyomavirů
Ryšavá, Markéta
S lidskými polyomaviry se většina lidské populace setká v dětství, kdy je první infekce bezpříznaková či s mírnými symptomy. Tyto viry ovšem v lidském těle perzistují a reaktivují se nejčastěji při imunosupresi. S reaktivací JC viru je spojena progresivní multifokální encefalopatie. S BK virem je spojena hemoragická cystitida, která má za následek ztrátu aloštěpu při transplantaci ledviny. Přesnou diagnostikou lze viry včas detekovat a zmírnit poškození tkáně. Tato diplomová práce se zabývá biotechnologiemi, které lze při detekci virů využít se zaměřením na real-time PCR, která je v diagnostice virů zlatým standardem. Literární rešerše shrnuje základní informace o polyomavirech se zaměřením na lidské polyomaviry BKV a JCV. Shrnuje biotechnologické metody používané k detekci polyomavirů, jak v rámci rutinní diagnostiky, tak alternativní přístupy zahrnující biosenzory a CRISPR. Experimentální část práce zahrnuje návrh detekčního systému pro polyomaviry od in silico analýzy genomu, přes návrh potenciálních primerů, po teoretickou analýzu specificity. Praktická část práce pak porovnává účinnost a senzitivitu amplifikace dvou re-akčních směsí, kdy je jedna určena pro jednoduché systémy a druhá pro multiplexy. Dále zahrnuje testování vybraných aditiv PCR a stanovení citlivosti a parametrů validity testu reakční směsi vybrané pro vývoj PCR systému. Výsledky poukázaly, že detekce pomocí multiplex reakční směsi je dostatečně citlivá, jelikož splňuje podmínky a požadavky klinických doporučení a současně vykazuje velmi dobré hodnoty senzitivity a specificity testu srovnatelné s publikovanými technologiemi. Tato reakční směs se jeví jako relevantní k použití vývoje a optimalizaci PCR systému pro detekci polyomavirů.
|
|
|
Optimization of CRISPR/Cas9 technique for the Ixodes ticks genome editing
KITZBERGER, Daniel
CRISPR/Cas9 technique was used for genome editing of several arthropod species, but it has not yet been used on Ixodes spp. tick species. Therefore, in my work, I performed a bioinformatic analysis of the I. ricinus transcriptome and I. scapularis genome to reveal the sequence of the target gene for the CRISPR/Cas9-mediated knock-out. We prepared single guide RNA and mixed it with the Cas9 endonuclease to produce the Ribonucleoprotein complex and cleave the target sequence of the I. ricinus gene beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase.
|
|
|
Boj za lidskou důstojnost v éře moderní eugeniky. Molekulární nástroj editace genomu CRISPR/CAS9 a jeho užití v lidské genové terapii z pohledu teologické etiky
Auxt, Miroslav ; Štica, Petr (vedoucí práce) ; Fošum, Jan (oponent)
Nedávný průlomový objev molekulárního nástroje editace genomu CRISPR/CAS9 představuje v oblasti molekulární biologie, biomedicíny a dalších přidružených oborů naprostou revoluci. Jedná se o vysoce efektivní biomolekulární nástroj, odvozený od bakteriálního imunitního systému, kterým je možné zavádět přesné změny v genomech všech organismů. Diplomová práce se omezuje na etické hodnocení použití CRISPR/CAS9 výlučně v lidské genové terapii. Díky efektivitě, jednoduchosti, přesnosti a nízkým finančním nákladům má již nyní editační nástroj CRISPR/CAS9, při dodrženi etických parametrů, širokospektrální využití v terapeutických postupech na somatických neboli tělních buňkách při léčení lidských geneticky podmíněných onemocnění bez zavedení změny do budoucího potomstva daného jedince. Kromě velkého terapeutického potenciálu, aplikace CRISPR/CAS9 vyvolává mnohé etické otázky spojené s možnostmi jejího dalšího využití, příp. zneužití. Mezi eticky problematické genetické postupy se řadí: lidská dědičná editace genomu, tedy cílené pozměňování genomu pohlavních buněk, progenitorových buněk a buněk raných embryonálních vývojových stadií s terapeutickým cílem eliminace geneticky podmíněného onemocnění spojeného se zavedením této změny do budoucího potomstva daného jedince. Dále jsou to kontroverzní neterapeutické...
|
|
|
Biogenesis, structure and physiological functions of mitochondrial ATP synthase
Eliáš, Jan ; Mráček, Tomáš (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Savčí mitochondriální ATP syntáza je enzym skládající se z 18 proteinových podjednotek, jenž se nachází ve vnitřní membráně mitochondrie. Její hlavní funkcí je využívat protonový gradient, který je utvářen komplexy respiračního řetězce (RCC), za účelem tvorby ATP. Vedle tvorby ATP je známo, že se dimery ATP syntázy podílejí na správné mitochondriální morfologii skrze tvorbu apexů krist. Dále bylo navrženo, že je rovněž zapojena ve fenoménu mitochondriální přechodné propustnosti, který má důležitou funkci v regulaci programované buněčné smrti. V posledních letech bylo na poli studia biogeneze savčí ATP syntázy dosaženo řady úspěchů. Proces jejího sestavování je nyní objasněn, nicméně poznatky o asemblačních faktorech periferního stonku a podjednotky c jsou stále neúplné. Právě za účelem zodpovězení těchto otázek na polích biogeneze a sekundarních rolí savčí ATP syntázy jsme vytvořili KO model katalytické β podjednotky F1 části savčí ATP syntázy (βKO). Tento model byl připraven na pozadí buněčné linie HEK293. Jeho následná charakterizace ukázala, že narušení F1 struktury enzymu vyústilo v nemožnost složení funkčního monomeru a došlo k rozpadu jednotlivých podjednotek. Jediným stabilním asemblačním intermediátem, jenž byl odhalen, byl oktamer podjednotky c, který oproti kontrole vykazoval zvýšenou stabilitu. V...
|
|
|
Analýza genové rodiny Gretchen Hagen 3 v buněčných kulturách BY-2 tabáku
Helusová, Lenka ; Müller, Karel (vedoucí práce) ; Pěnčík, Aleš (oponent)
Konjugace auxinu patří k zásadním metabolickým procesům regulujících aktivitu auxinu v rostlinných buňkách. Mezi důležité enzymy konjugující auxin s aminokyselinami patří skupina amidoacyl syntetáz z rodiny Gretchen Hagen 3 (GH3). Díky existenci citlivějších metod detekce auxinových metabolitů i aktuálnosti studia účinku abiotických stresů je v poslední době výzkum GH3 enzymů na vzestupu. Lépe známy jsou tyto enzymy u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana), sóji (Glycine max) a rýže (Oryza sativa). Tyto modely však neumožňují detailnější biochemické studium jejich aktivit. Proto bylo cílem této práce sledování metabolismu auxinu v zavedeném modelu tabákových buněčných linií BY-2 (Nicotiana tabacum). Geny NtGH3.1 a NtGH3.6, u kterých byla v tomto systému prokázána variabilní regulace jejich exprese auxinem, byly cíleně mutovány metodou CRISPR/Cas9. Mutace v odvozených liniích byly ověřeny sekvenací a u těchto linií byl analyzován pomocí LC/MS metabolický profil auxinu. Toto metabolické profilování poukázalo na souvislost formy NtGH3.6d se specifickou produkcí metabolitu oxIAA-Gln (N-(2-oxindol-3-acetyl)-glutamin). Studium případné zástupnosti jednotlivých forem genů GH3 v mutovaných liniích metodou RT-qPCR ukázalo, že zástupnost je nejspíš poměrně malá. Jednotlivé geny byly také označeny pomocí...
|
|
|
CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis
Sypecká, Markéta ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Editace leukemických B-buněk pomocí CRISPR/Cas9: hledání cílů miR-155 účastnících se procesu leukemogeneze Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (chronická lymfoidní leukémie, CLL) je monoklonální porucha charakterizovaná postupnou akumulací funkčně nekompetentních B- lymfocytů. CLL je nejběžnější formou leukémie u dospělých v západních zemích. Průběh onemocnění se může lišit: někteří pacienti umírají rychle, během 2-3 let od diagnózy, převážně kvůli komplikacím z CLL, ale většina pacientů žije 5-10 let. S progresi nemoci stoupá exprese miR-155, která je označována jako oncomiR. MikroRNA (miRNA) představují negativní regulátory genové exprese. MiR-155 ovlivňuje geny, které se účastní leukemogeneze a buněčného cyklu. A je známo, že miR-155 (podobně jako i jiné miRNA) potlačuje své cíle. Předpokládali jsme, že úpravou genů v CLL bunkách odblokujeme cíle miR-155 a zjistíme korelaci mezi těmito cíli (známými a neznámými) s leukemogenezí CLL. Metody: Metodu, kterou jsme použili pro editaci genů, je CRISPR/Cas9, která umožňuje odstranit sekvenci maturované miR-155 v genomu leukemických B-buněk. K přenosu plasmidu CRISPR/Cas9 byla využita metoda nukleofekce. K identifikaci buněčných klonů s úspěšnou transfekcí plasmidu CRISPR/Cas9 došlo pomocí FACS a míra exprese jednotlivých genů byla měřena pomocí...
|
|
|
CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis
Sypecká, Markéta ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Editace leukemických B-buněk pomocí CRISPR/Cas9: hledání cílů miR-155 účastnících se procesu leukemogeneze Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (chronická lymfoidní leukémie, CLL) je monoklonální porucha charakterizovaná postupnou akumulací funkčně nekompetentních B- lymfocytů. CLL je nejběžnější formou leukémie u dospělých v západních zemích. Průběh onemocnění se může lišit: někteří pacienti umírají rychle, během 2-3 let od diagnózy, převážně kvůli komplikacím z CLL, ale většina pacientů žije 5-10 let. S progresi nemoci stoupá exprese miR-155, která je označována jako oncomiR. MikroRNA (miRNA) představují negativní regulátory genové exprese. MiR-155 ovlivňuje geny, které se účastní leukemogeneze a buněčného cyklu. A je známo, že miR-155 (podobne jako i jiné miRNA) potlačuje své cíle. Předpokládali jsme, že úpravou genů v CLL bunkách odblokujeme cíle miR-155 a zjistíme korelaci mezi těmito cíli (známými a neznámými) s leukemogenezí CLL. Metody: Metodu, kterou jsme použili pro editaci genů, je CRISPR / Cas9, která umožňuje odstranit sekvenci maturované miR-155 v genomu leukemických B-buněk.K přenosu plasmidu CRISPR/Cas9 byla využita metoda nukleofekce. K identifikaci buněčných klonů s úspěšnou transfekcí plasmidu CRISPR/Cas9 došlo pomocí FACS a míra exprese jednotlivých genů byla měřena pomocí...
|
host ::
RSS.